7.目的
てん菜そう根病の発生を予測できる土壌検診法の開発を行い、てん菜の安定多収生産に資する。

8.試験研究方法
(1)病原ウイルスの検出法
1)DNAプローブ法の開発:cDNAの作成、クローニング、非放射性標識法、RNA検出、識別条件について検討
2)ダイバ法の利用:エライザ法との比較
(2)土壌検診法
1)直接的手法;病原ウイルス:土壌抽出液を濃縮してエライザ法で検定
P.betae:蛍光色素で染色して蛍光顕微鏡で観察
2)間接的手法;宿主植物による捕捉:試験管育苗法など5つの方法
病原ウイルスの検出:エライザ法
(3)現地土壌の検診
1)対象圃場:部分発生の4圃場から合計39地点を選定
2)検診方法;試験管育苗法の土壌・石英砂混合接種(5:5)および改良ポリカップ法

9.結果の概要・要約
(1)病原ウイルスの検出法
1)病原ウイルスに存在する5種類のRNAからcDNAを作成し、クローニングを行った。
2)cDNAをプローブとして非放射性標識法(ジゴキシゲニン法)によるウイルスRNAの検出法を開発した
3)ダイバ法によるウイルスの検出法を検討した。
4)エライザ法は大量のサンプルのウイルス検定、ダイバ法は極微量のサンプルの短時間検定、DNAプローブ法はウイルスRNAの識別と検定に各々利用することができる。
(2)土壌検診法
1)直接的に土壌中から病原ウイルスを検出するために、発病土壌の抽出液をPEGで1/100に濃縮し、エライザ法で検定したが、ウイルスは検出されなかった。
2)直接的にPolymyxa betaeを検出するために、カルコフルオールホワイトMR2、臭化エチジウムなど5種類の蛍光色素を使用して休眠胞子を染色したが、いずれの色素でも実用できるほどの蛍光を発しなかった。
3)間接的な手法では宿主植物を用いて土壌中からウイルスを捕捉し、これをエライザ法で検定した。
4)病原ウイルスを捕促する方法としては、試験管育苗法、素焼鉢育苗法、土壌懸濁液浸漬法、ポリカップ法、改良ポリカップ法について検討した。その結果試験管育苗法が最も感度が高く、簡便で実用的であると考えられた。また改良ポリカップ法も感度としては前者とほぼ同じであった。
5)試験管育苗法では捕捉植物にはてん菜苗(20〜40日苗)、培養液は一部改変Hoagland and Arnon氏液接種には土壌・石英砂混合(5:5)、インキュウペーションには25℃で10000lux 16時間照明が最適であると認められた。
6)これらの条件下では、少発生の土壌、あるいは多発生土壌の1/1000希釈からでも、接種後1〜2週間目に病原ウイルスが検出できた。
(3)現地土壌の検診
部分発生(スポット状、帯状)の4圃場合計39地点から採取した土壌について、試験管育苗法(土壌・石英砂混合接種5:5)と改良ポリカップ法で検診した結果、病原ウイルスの検出程度と圃場における各地点でのそう根病の発生程度および被害とほぼ一致した。

10.成果の具体的数字

ジコキシゲニン標識法によるウイルスRNAの検出
プローブは各cDNA
1:RNA-1 2:RNA-2 3:RNA-3
4:RNA-4 5:RNA-5
サンプルは5種類のRNAを含む

ウイルス検出感度の比較

検出法	検出限界量	検出限界濃度	使用量
	ng	ng/mL	μL
エライザ法	1(ウイルス量)	5	200
ダイバ法	0.1(ウイルス量)	100	1
DNAプローブ法	0.1(RNA量)	2000	1

3つの土壌検診法における病土混合割合と
　　病原ウイルスの検出程度

現地ほ場における土壌検診結果
(試験管育苗法:土壌・石英砂5:5)

11.成果の活用面と留意点
(1)ウイルスの検定には、目的に応じてエライザ法、ダイパ法、DNAプローブ法(遺伝子診断)を利用できる。
(2)土壌診断には試験管育苗法(土壌・石英砂混合接種5:5)または改良ポリカップ法を用いる。
(3)育苗および検定中の汚染防止に十分注意する。

12.残された問題とその対応
(1)直接的手法による検診技術の開発
(2)土壌中の病原ウイルス(およびP.betae)の定量法の確立