成績概要書(作成　平成9年1月)

課題の分類 研究課題名:遺伝子診断(RAPD法)のための種子からの簡易DNA抽出法 　　　　　　（先端技術開発研究−遺伝子操作技術の開発） 予算区分:道費 研究期間:平6〜8年度 担当科:中央農試生工部遺伝子工学科 協力・分担関係:

１．目的
　近年の遺伝子工学的手法の発展により、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）を利用した遺伝子診断法が種々の分野で活用されている。作物においてもこの遺伝子診断技術、特にRAPD(random amplified polymorphicDNA)マーカーによる診断技術を適用するために、種子からの簡便なDNA抽出法を開発する。

２．方法
　1)供試材料:大豆、小豆、菜豆の豆類種子および馬鈴しょ塊茎、イネ玄米を供試した。
　2)試料採取法:種子からの試料採種法について検討した。豆類とイネについては試料採取後の種子の発芽試験を実施した。
　3)DNA抽出去:採取した試料からのDNA抽出法について検討した。また、市販の核酸抽出用キットとの比較を行った。

３．結果の概要
　1)種子からの試料採取は、豆類では種子の子葉中央部こドリルで穴を開け、キリ屑を試料とした。
　馬鈴しょ塊茎では、先端を切り落としたイエローチップを突き束すことにより、またイネでは玄米をハサミで切断することにより、試料を得ることが河能であった。
　2)試料採取後の種子の発芽試験では大豆、菜豆、玄米では発芽に支障は認められなかったが，小豆では穴開け時に胚や幼根を欠いたものがあり、発芽率は劣った。
　3)試料からの簡易なDNA抽出去として、プロテナーゼ-Kを用いる方法(pK法)を適用した。標準的なCTABを用いる方法に比べ簡便で、2時間以内に作業は終了した。市販の核酸抽出用キットとの比較では，得られるDNA抽出物の収量や純度は市販のキットでやや勝る傾向が見られたが、ランダムプライマーによるPCRの結果には差は認められなかった。
　4)得られるDNA抽出物にはPCRの阻害物質が含まれていると思われその程度は作物、品種により異なった。そのため、得られた抽出物に応じて、10〜100倍に希釈することにより、安定して再現性のあるPCR産物を得ることができた。
　5)本法の応用例として、RAPD(random amplified polymorphicDNA)マーカーによる大豆の交雑種子の判定を行った。両親間の多型により、交雑の正否の判定が河能であった。

4.成果の活用と留意点
　1)RAPDマーカー等による、品種判別，遺伝資源の分類やDNAマーカー選抜に利用が期待できる。
　2)PCR法は感度が高いので、異種のDNAの混入に十分注意する。また、得られるDNA抽出物に応じて反応条件を最適化する。
　3)この成果は、豆類、馬鈴しょ塊茎、水稲に適用する。

5残された問題点とその対応
　1)選抜に有効なRAPDマーカーの探索。
　2)AFLPやマイクロサテライトマーカーへの適用の検討