【指導参考事項】
成績概要書 　　　　　　　　　　　　　　　 (作成　平成９年 1月）
課題の分類
研究課題名：ジャガイモそうか病菌の同定と識別
　　　　　　　（ジャガイモそうか病の総合防除法開発試験）
予算区分：道費、受託
担当科：十勝農試研究部病虫科
　　　　　北見農試研究部病虫科
　　　　　中央農試病虫部土壌微生物科
試験期間：平成６−８年度
協力・分担関係：中央農試生物工学部遺伝子工学科

１．目的：病原菌の同定・識別

２．方法：
１）病原菌の分類・同定（形態・生理・生化学的性質、ＤＮＡ相同性）、
２）アクチノファ一ジ法による病原菌識別、
３）血清学的手法による病原菌識別、
４）ＰＣＲ法による病原菌識別

３．結果の概要
　１）病原菌の分類・同定
　（１）北海道に発生しているそうか病菌は４種類が認められ、胞子鎖がらせん型の菌群はStreptomycesscabiessubsp.scabiesおよびS.scabiesachromogenes、直〜波状型の菌群はS.turgidiscabiesと同定された（表−１）。なお残りの１種類は未同定である。前２菌群は道央、道南地域に優占し、後２菌群は道東地域で優占した。
　（２）S.turgidiscabiesはｐＨ４．５で生育が抑制され、Ｆｅイオンが１０ｐｐｍあるとさらに抑制されたが、Ａｌイオン３０ｐｐｍでは影響されなかった。ｐＨ４．８ではこれらの影響は認められなかった。
　２）アクチノファージ法による病原菌の識別
　（１）ファージ検出法として重層法は滴下法より適していた。馬鈴薯株元土壌からそうか病菌に寄生性を示すファ一ジを分離した結果、４４４株を得た。この中から腐生放線菌に寄生しない１０１株のファ一ジを選抜し、さらにそうか病菌に特異的な８株のファ一ジを選抜した。
　（２）これらのファージはS.scabiessubsp.achromogenesに寄生し、北海通産のS.scabiessubsp.scabies,S.turgidiscabies、ＲＦ（十）および腐生放線菌に寄生しなかった（表−２）。これらのうちS.cabiesＡＴＣＣ４９１３７（S.scabiessubsp.scabies）に寄生するファージが５株あったが、北海道産S.scabiessubsp.scabiesには全く寄生しなかったので、ファージを用いたS.cabiessubsp.achromogenesの識別には問題ないと考えられた（表−２）。
　（３）S.diastatochromogenesに寄生するファージがあったが、本試験での供試菌株が少ないこと、本菌の北海道内での存否が不明であることから、今後本菌に対するファージの寄生性についてさらに検討する必要がある（表−２）。
　（４）以上から、ファージの宿主特異性により、そうか病菌のうちS.scabiessubsp.achromogenesを識別することが可能であると考えられる。即ち、本法により、そうか病菌を亜種レベルで識別できることが明らかとなった。
　３）血清学的手法による病原菌の識別
　（１）抗S.turgidiscabies血清をS.cabiessubsp.achromogenes,S.griseus,S.diastatochromogenesの３種の菌体抗原で吸収することにより、特異抗体が得られた。本抗体を用いたＥＬＩＳＡ（抗原吸着間接法）により、S.turgidiscabiesの識別が可能であった（表−３）。
　（２）抗S.scabies血清をS.turgidiscabies,S.bottropensis,S.diastatochromogenesの３種の生菌体で吸収することにより、特異性の高い抗体が得られ、ＥＬ１ＳＡの反応性が高かったが、S.diastatochromogenesのみが供試菌の中で非特異反応を示した。更に検討する必要がある。
４）ＰＣＲ法による病原菌の識別
　（１）そうか病菌S.scabies,S.turgidiscabies,S.acidiscabiesの３種の種特異的プライマーを用いたＰＣＲ法による平板コロニーからの識別、前２種の病斑からの簡易検出が可能である。(表-3)

表-1　　各種そうか病菌の類別
類別性質 Streptomyces 類別性質 Streptomyces
sca ach aci tur sp sca ach aci tur sp
胞子鎖 S S RF RF RF ミルク色素 + - - - -
マスカラー G G W G G pH4.0生育 - - + - -
メラニン色素 + - - - - pH4.5生育 - - + + +
黄緑色色素 - - - - + 37C生育 + + + - -
赤褐色色素 - - + - - クリスタルバイオレット - - + - -
sca:scabies,ach:achromogenes,aci:scidiscabies,tur:turgidiscabies

表-2　宿主特異的ファージによるscabiessubsp.achromogenesの識別
ファージ*1 そうか病菌 非そうか病菌
S.scabiessubsp. S.scabies*2 S.turgidi
scabies		 RF(+) S.acidi
scabies		 S.diasta
tochromo
genese		 腐生性
放線菌
achromogenes scabies ATCC
49173T		 ATCC
33282T
9*3 4 1 5 1 1 1 1 1 3 11 1 1 31 3 1 1 107
φ162 + + - + - + - - + - - + - - - - + -
φ163 + + + + + - - - - - - - - - - - - -
φ164 + + + + + + - + - - - + - - - - + -
φ165 + + + + + + - - - - - + - - - - + -
φ166 + - + - - - + - - - - - - - - - - -
φ168 + + + - + - + - - - - - - - - - - -
φ169 + + + + + + - - - - - + - - - - + -
φ170 + + + + + + - - - - - + - - - - + -
*1　1994年に倶知安町より分離されたファージ
*2　Typestrain(メラニン様色素生産性(+)であり、S.scabies　subsp.scabiesに該当すると考えられる。)
*3　該当指示菌株数
RF(+):Streptomyces　sp.、直波型胞子鎖、色素生産性(+)のそうか病菌。

表-3　ELISA法およびPCR法による病原菌の識別
供試菌種 菌株数 ELISA法(吸光度)a PCR法b
抗S.s抗体 抗S.t抗体 S.s-P S.t-P S.a-P
S.scabiessubsp.scabies 11 1.25〜2.0< 0.07〜0.10 +(11/11) - -
S.s.subsp.achromogenes 13 1.23〜2.0< 0.07〜0.09 +(13/13) - -
S.turgidiscabies 43 0.07〜0.15 1.58〜2.0< - +(43/43) -
S.acidiscabies 2 0.10〜0.12 0.08〜0.09 - - +(2/2)
S.sampsonii 1 0.08 0.08 - - -
S.tenndae 1 0.07 0.07 - - -
S.griseus 3 0.07〜0.12 0.10 - - -
S.diastatochromogenes 2 0.64〜0.98 0.12〜0.20 - - -
S.neyagawaensis 1 0.08 0.08 - - -
S.eurythermus 1 0.08 0.07 - - -
S.bottropensis 1 0.25 0.08 - - -
S.setonii 1 0.09 0.09 - - -
S.aureofaciens 1 0.08 NT - - -
S.flaveolus 1 0.07 NT - - -
S.antibioticus 1 0.08 NT - - -
Nocardiabrasiliensis 1 0.09 NT - - -
未同定非病原菌 16 0.07〜0.23 0.07〜0.11 - - -
a　抗S.s抗体;抗S.scabies抗体、抗S.t抗体;抗S.turgidiscabies抗体
b　S.s-P,t-p,S.a-p;それぞれS.scabies,S.turgidiscabies,S.acidiscabies用プライマー

４．成果の活用面と留意点
１）各種作物のそうか病類似サンプルの迅速な診断が可能となる。
２）土壌中のそうか病菌の定量法を開発するための重要な基礎的知見となる。

５．残された問題点とその対応
１）未同定病原菌の同定（ＲＦ（＋）等）、
２）病原菌の特性解明（金属、ｐＨ、水分耐性等）、
３）土壌中の病原菌の定量法開発と生態解明、（方法の開発、S.diastatochromogenesの評価など）。
　今後の課題の中でさらに継続する。