【研究参考】
成績概要書 (作成 平成9年 1月)
課題の分類 研究課題名:RT−PCR法によるテンサイそう根病ウイルスの検出 (作物ウイルス病の防除技術開発) 予算区分:道費 担当科:中央農試生物工学部遺伝子工学科 試験期間:平成6〜8年 協力・分担関係:なし |
1.目的
テンサイそう根病は、カビの一種Polymyxabetaeによって媒介されるウイルス病である。病原ウイルスは外被タンパク質と4〜5種類のRNA遺伝子から成る。近年開発された、極微量のDNAを数時間の間に増幅する技術PCR法を利用して、てんさいの根からPCR法により簡便にウイルスRNAを検出し、ウイルスの系統を診断する手法を開発する。
2.試験方法
①供試材料
ウイルス分離株S−45(RNA−1+2+4+5)またはS−345(RNA−1+2+3+4+5)に感染したてんさい細根、発病圃場から採取したてんさい・土壌
②核酸の調製
SDS−フェノール法、lSOPLANT(ニッポンジーン)、Sepagene(三光純薬)
③RT−PCR
逆転写酵素(スーパースクリプトⅡ,GIBCO−BRL)でファーストストランドを合成し、PCRを行った(94℃−1分・50℃−1分・72℃−2分のサイクルを35回)。
④土壌検診
土壌にてんさいの苗を移植し、細根をエライザ法とRT−PCR法で検定した。
3.結果の概要
①てんさいの根からRT−PCR用の核酸を調製する方法として、従来から用いているSDS−フェノール法と2つの市販のキット(ISOPLANTおよびSepagene)とを比較した。根からの核酸調製には、検出感度からみて、Sepageneが適していた。核酸は、生重に対して10倍に希釈して用いるのが適当であると考えられた。
②てんさいの根からSepageneを用いて核酸を調製し、RNA−3、RNA−4およびRNA−5に対するプライマーを設定して特異性と感度を比較し、各RNAを特異的に検出できるプライマーをスクリーニングした。検出感度はエライザ法とほぼ同等であった。これらのプライマーを用いて、発病圃場より採取したてんさいの根からウイルスRNAを検出することができた。
③ウイルス濃度の高い土と低い土を用いて、エライザ法とRT−PCR法による土壌検診の感度を比較した。RT−PCR法では、いずれの土からも病土移植5日後のてんさい苗の細根からウイルスRNAが検出され、エライザ法と同等以上の感度が得られた。発病圃場から採取した土壌をRT−PCR法で検定したところ、RNA−3、RNA−5を検出することができ、ウイルス系統を診断することができた。
表1 異なる方法で調製した核酸からのRT-PCR法
によるウイルスRNAの検出
核酸調製法 | 生重に対する希釈倍率 | ||||||
1 | 10 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | |
SDS-フェノール法 | - | + | + | + | + | + | - |
ISOPLANT | NT | - | + | + | + | + | - |
SepaGene | NT | + | + | + | + | + | + |
表2 エライザ法とRT-PCR法による土壌検診の感度
土壌 | 移植後 日数 |
エライザ法 | RT-PCR法 | |||
30分の吸光度 (A405) |
60分の吸光度 (AA405) |
検出 | RNA-3 | RNA-5 | ||
So4 | 5 | 0.009 | 0.018 | - | - | - |
0.020 | 0.047 | - | + | + | ||
0.009 | 0.O15 | - | - | - | ||
15 | 0.020 | 0.045 | - | - | - | |
0.019 | 0.042 | - | - | - | ||
0.025 | 0.056 | - | + | + | ||
Bi6 | 5 | 0.120 | 0.298 | + | + | + |
0.134 | 0.337 | + | + | + | ||
0.084 | 0.201 | + | + | + | ||
健全 | 5 | 0.008 | 0.015 | - | - | - |
15 | 0.O10 | 0.015 | - | - | - |
4.得られた成果とその活用
①RT−PCR法によりテンサイそう根病ウイルスのRNA−3、RNA−4およびRNA−5を検出することができ、診断に利用できる。
②検診土壌に移植したてんさい苗の細根または圃場から採取したてんさいの根を用いてRT−PCR法によりウイルスの系統を検定することができる。
③RT−PCR用の核酸は、てんさいの根から市販のキットを用いて調製することができる。
④ここで得られた知見は、塩基配列情報のある他のウイルスに利用できる。
⑤PCR法を利用した多型検出法の一つ、SSCP(singlestrandconformationpolymorphism、一本鎖高次構造多型)法に応用できる。
5.残された問題点
①さらに簡便な核酸調製法の開発およびPCRの省力化
②直接的な検出法の開発
③定量法の開発