成績概要書　 　　 　　　　　　　　　　　　　　 （作成　平成11年1月）
研究課題名:　キャピラリーＰＣＲ法による牛胚性判別所要時間の短縮
　　　　　　 （キャピラリーＰＣＲによる牛胚性判別実用技術の確立）
予算区分:　　道費
担当科：新得畜試　生産技術部　生物工学科
研究期間：平７−９年度
協力・分担関係：　なし 　

　１．目　的

ＰＣＲ法を用いた牛胚の性判別技術を実用化し普及させるにあたって，改善が求められているＰＣＲ所要時間の短縮について、最近開発されたキャピラリーＰＣＲ装置を用いた条件について検討し、併せて判別胚の移植試験を行う。

　２．方　法

１）キャピラリーＰＣＲ法の検討
サンプル量、試薬量、反応時間・温度などについて、従来法と比較しながら最適な条件を検討した。
２）性判別胚の移植による実証試験
当場で性判別した胚を十勝管内の３地区の農家で用意した受胚牛に移植した。

　３．結果の概要

１）キャピラリーＰＣＲ装置を用いて，これまでと同じ条件でＰＣＲを行った場合，既存の装置に比べて温度の上昇下降速度が速いため，ＰＣＲ所要時間は約30分短縮された。
２）表２に示した条件でキャピラリーＰＣＲを行った場合、典型的な１サイクルの長さは図１のようになり、ＰＣＲ所要時間は従来法（表１）の３時間から１時間10分程度に短縮できた。
３）キャピラリーＰＣＲ法において、安定した増幅結果を得るために特に影響が大きかったのは、反応初期の時間設定とＤＮＡ合成酵素の量であった。この条件において検出できたのは1pgまでで、従来法の0.5pgと比べて感度が低かった。　　
４）同じ体内受精胚に由来するＤＮＡサンプルを２つに分けて、それぞれをキャピラリーＰＣＲ法と従来法のテンプレートとして用い、判別率（判別できた胚数／供試胚数）を比較したところ、それぞれ78.5％、89.2％であり、キャピラリーＰＣＲ法の判別率は従来法に及ばなかった（表３）。なお、判別できた胚の性別は両法で一致していた。　
５）キャピラリーＰＣＲ法により性判別した胚の移植実証試験では、受胎率57.1％、判別率76.3％、判定一致率100%であった（表４）。
以上の結果から、牛胚の性判別にキャピラリーＰＣＲ法を用いることにより、判別率は及ばないものの、ＰＣＲ所要時間を従来の３時間から１時間10分程度に短縮できることが示された。

表１．ＰＣＲ反応条件（従来法）
サンプル 10μl
ＰＣＲ反応液 40μl
反応緩衝液（10倍） 　5.0μl 　
dＮＴＰs 　200μM
耐熱性DNA
ポリメラーゼ		 　1.0　U
プライマー 各15pmol
マグネシウム 　1.5 mM
計 50μl
PCR
プログラム 		１サイクルの
設定温度と時間 		各サイクルの
反復回数
95℃(3分) 　1回
95℃ - 52℃ - 72℃ 45回
(30秒)　(45秒)　(45秒) 　
72℃(5分) 　1回
ＰＣＲ所要時間 ３時間 　

表２．キャピラリーＰＣＲ法の反応条件
サンプル 5μl
ＰＣＲ反応液 15μl
反応緩衝液（10倍） 　2.0μl 　
dＮＴＰs 　200μM
耐熱性DNA
ポリメラーゼ		 　1.0　U
プライマー 各15pmol
マグネシウム 　3.0 mM
計 20μl
PCR
プログラム 		１サイクルの
設定温度と時間 		各サイクルの
反復回数
95℃(3分) 　1回
95℃ - 52℃ - 72℃ 　5回
(15秒)　(30秒)　(20秒) 　
95℃ - 52℃ - 72℃ 40回
(10秒)　(15秒)　(5秒) 　
ＰＣＲ所要時間 ３時間 　
　

表３．ＰＣＲ方式による判別率の比較成績
PCR方式 供試胚数 判別できた胚数 判別率
キャピラリー法
従来法		 　　223
　　223　		 175(♂111,♀64)
199(♂122,♀77)
 　78.5%
　89.2%　
　使用プライマー：Ｓ４−Ｂ

表４．キャピラリーＰＣＲ法による性判別移植成績
供試胚数 判別結果 判別率(%) 移植頭数1) 受胎頭数(%) 分娩頭数 判定一致率
38 29 76.3 14 8(57.1) 8 100%



 ♂　17
♀　12
判別不可 9		 　 6
4
4 		4
1
3 		♂4
♀1
♂2,♀1		 　
　1)新鮮胚移植

４．成果の活用面と留意点
　　１）判別率の低下を考慮しても、時間短縮が優先する場合は有効な方法である。
　　２）現状では性判別胚の凍結法については未確立なので、当面は新鮮胚移植と組み合わせての利用となる。

５．残された問題とその対応
　　１）キヤピラリーＰＣＲ法の判別率向上