成績概要書

研究課題名：牛胚性判別技術の現場応用 　　　　　　　（農家の庭先における牛胚の性判別実証試験） 予算区分：共同 担当科：新得畜試　生産技術部　生物工学科 研究期間：平10年度 協力分担関係：北海道家畜改良事業団

１．目的
　PCRによる牛胚の性判別技術の普及・定着をめざし、北海道全域をカバーするために、性判別を性判別施設で行う胚輸送方式（近距離対応）と、農家の庭先で行う庭先方式（遠距離対応）の２つの方式を設定し、その有効性を検討した。

２．方法
１）胚輸送方式
　農家で回収した胚を性判別施設に輸送し、サンプリング後、再び胚を移植場所へ輸送し、輸送および移植の準備をする間に性判別を行う方法で、性判別施設と胚の回収・移植場所との距離が車で２〜３時間の場所での適用を想定した。
２）庭先方式
　簡易な実験室を設置したマイクロバスに胚回収、移植、胚の性判別用の器材を積載し、農家の庭先まで出かけて胚回収から性判別、移植までを実施する方法で、性判別施設からの距離が車で４時間を超える場所での適用を想定した。
(1)作業効率の検討（庭先方式、胚輸送方式）
　農家での胚回収、ET車内での胚の検索、胚からのサンプリング、胚の培養、PCR、胚移植の一連の作業の効率化を検討した。　
(2)PCR所要時間短縮の検討（庭先方式、胚輸送方式）
　PCRの準備から電気泳動までのPCR所要時間（約４時間）が全体の作業時間に占める割合は高いので、PCRの反応や電気泳動時間の短縮化を検討した。
(3)作業環境の清浄度の検討（庭先方式）
　ET車内ではサンプル処理中における異物混入の可能性が高いので、作業環境の清浄度の検討を行った。

３．結果の概要
１）胚輸送方式
(1)胚回収頭数は12頭、性判別に供試した胚数は125個で、性別判明率は92.0％であった。移植頭数は52頭で、受胎率は50.0％(23/46)であり、調査期間中に分娩に至った産子５頭の性別は判定結果と全て一致していた（表１および表２）。
(2)胚の発育ステージおよびランクによって受胎率は大きく影響を受けた（表３）。
(3)供試胚数30個程度であれば、胚回収から移植までを１日の作業（勤務時間内での対応）として可能と思われた。
２）庭先方式
(1)ET車内（図１）で胚検索、サンプリング、およびPCRなどの作業を３人で分担し並行して行うことにより、最も効率的に作業することができた。
(2)作業環境の清浄度を保つため、ET車内と車外での作業者を分け、ET車は前日に設置して　殺菌灯を点灯した。これまでのところ異物混入による誤判別は発生していない。
(3)胚回収頭数は19頭、性判別に供試した胚数は64個で、性別判明率は90.6％であった。移　植頭数は29頭で、受胎率は20.7％(6/29)であり、分娩に至った産子6頭の性別は判定結果　と全て一致していた。（表４および表５）。
(4)採取した胚は桑実胚が約60％と若い胚が多く、また、胚のランクはＢおよびＣランクが　50％を占めていた。このことが低受胎率の原因のひとつと考えられた（表６）。
３）サンプリングおよび性判別
(1)PCRおよび電気泳動時間の短縮により、PCR所要時間は４時間から３時間弱にすることができた。
　以上の結果から、PCR作業の間に移植場所まで胚を輸送することにより、性判別施設から車で2〜3時間離れた地域でも性判別技術を利用できることが示された。また、ET車とPCRの組み合わせにより、農家の庭先で胚回収から性判別、移植までの一連の作業が実施可能であることが実証された。

図１．ET車平面図
（北海道家畜改良事業団所有）
凍：凍結機　　　記：胚形態記録装置
実：実体顕微鏡　Hp：ホットプレート
Ｍ:マイクロマニピュレータ

４．成果の活用面と留意点
１）低品質胚および若齢胚の性判別後の受胎率は低いので、良質で適切な発育ステージの胚の利用を基本とする。
２）移植する胚がない場合（胚が回収されない、胚の品質が悪い、胚の発育ステージが若すぎる、判別結果が雄ばかりなど）を想定して、凍結胚の準備などをあらかじめ計画しておくこと。
３）インキュベータの設置や顕微鏡下での作業を安定して行うために、ET車の設置場所は極力水平で屋根や囲いのある場所を用意する。

５．残された問題とその対応
１）性判別胚の凍結保存技術の確立