1.目的
　コムギ縞萎縮ウイルス(WYMV)は、コムギの根に寄生する土壌菌Polymyxa graminisによって媒介される土壌伝染性のウイルスである。現在の主要品種「ホクシン」は、コムギ縞萎縮病に弱く、「ホクシン」の作付増加に伴い、本ウイルスの分布が拡大している。そこで、道内における発生実態調査および抵抗性系統の早期選抜のために、遺伝子工学的手法を利用して、コムギ縞萎縮ウイルスの実用的な検出技術を確立する。

2.方法
　1)病原ウイルスの抗体作成
　通常の手法では抗原となるウイルス粒子の純化が困難だったため、ウイルスの遺伝子を単離し、大腸菌発現系を用いて、抗体作成のための抗原を得た(図1)。
　　コムギ縞萎縮ウイルスのエライザ法による検出法の確立
　　　↓
　　ウイルスの抗血清が必要
　　　↓
　　抗原となるウイルス粒子(タンパク)が多量に必要
　　　↓
　　コムギ縞萎縮ウイルスの大量純化が困難
　　　↓
　　ウイルスの外被タンパク質(CP)遺伝子を単離
　　　↓
　　大腸菌に組み込みCPを大量発現させる
　　　↓
　　大腸菌につくらせたウイルスのタンパク質を抗原に利用
　　　↓
　　抗血清(抗体)の作成

　2)エライザ法による検出
　作成した抗体を用いて直接法(二重抗体法)で行った。

　3)遺伝子診断による高感度検出
　コムギ縞萎縮ウイルスのCP遺伝子を特異的に検出するRT-nested PCR法を行った。

3.結果の概要・要約
　1)伊達市「ホクシン」の病葉から、コムギ縞萎縮ウイルスのRNAを抽出し、RT-PCR法によって外被タンパク質(CP)遺伝子を単離した。
　2)単離したCP遺伝子を大腸菌に組み込んだところ、コムギ縞萎縮ウイルスの外被タンパク質(CP)を大量に発現させることができた(図2)。大量発現したCPをカラムで精製して、抗血清作成のための抗原を得た。
　3)得られた抗原をウサギに免疫し、抗血清(抗体)を作成した。作成した抗体を用い、エライザ法によってウイルスの検出を行った結果、病葉の10,000倍希釈液からも検出できた(図3)。
　4)エライザによるコムギからのウイルス検出部位を検討した結果、最上位展開葉では吸光値が低下し(図4)、葉身部位では先端で吸光値が高まった。したがって、エライザ検定は、最上位展開葉の1枚下の葉の先端部を検定用サンプルとする。
　5)コムギ縞萎縮ウイルスのCP遺伝子を検出する遺伝子診断、RT-nestedPCR法による高感度検出技術を開発した。RT-nestedPCRによる検出感度はエライザの約1,000倍であった。

図1　コムギ縞萎縮ウイルスの外被タンパク質(CP)遺伝子の単離と大腸菌での大量発現

図2　大腸菌で発見されたウイルス外被タンパク質(CP)

図3　エライザによるウイルスの検出感度

図4　エライザによるコムギの検定葉位(n枚目：最上位展開葉からの枚数)

4.成果の活用面と留意点