【指導参考事項】

１９９５２５６

成績概要書　　　　（作成平成８年１月）

１．目的

　本試験では、胚移植に用いる良質の胚を多量に安定して確保することを目的とし、卵子の有効利用法、すべての種雄牛に有効な受精能獲得誘起法、および体細胞との共培養によらない発生培養法を検討し、安定して高率に胚盤胞の得られる体外受精技術の確立を目指す。

２．方法

（１）卵子の成熟培養卵巣から吸引採取したすべての卵子を卵丘細胞の付着量および膨化程度により分類し、１卵巣当たりの卵子数、それぞれの卵子の分割率、８細胞期および胚盤胞への発生率を検討した。

（２）精子の受精能獲得誘起受精培地としてカフェインを含むＢＯ液を用い、受精培地に添加したカルシウムイオノホアまたはヘパリンが前核形成に及ぼす影響を検討した。

（３）体外受精胚の発生培養発生培地に血清を添加した修正ＴＡＬＰを用い、発生培養において酸素濃度および卵丘細胞の有無が体外受精胚の発生に及ぼす影響を検討した。

３．結果の概要

（１）卵子の成熟培養卵巣１個当りの平均採取卵子数は１０．６個で、われわれが通常実験に用いている良質卵子およびそれに準ずる卵子は、それらの卵子のうち３．４個、３２．２％であった。良質卵子およびそれに準ずる卵子以外のいずれの区においても胚盤胞が得られた。しかし、放射冠の無い卵子は、変性卵の割合が高く、体外受精後の分割卵および胚盤胞の割合とも低く、放射冠の一部を欠く卵子も胚盤胞の割合は低かった。卵子の成熟には卵丘細胞とくに放射冠が重要であることが示された。

（２）精子の受精能獲得誘起前核形成卵の割合はＢＯ液のみの区で低かったが、ヘパリンを添加した区では、３頭の種雄牛において最も高く、１頭の種雄牛でも他の区と差はなく高かった。これらのことから、カルシウムイオノホア単独あるいはカルシウムイオノホアとヘパリンの併用よりも、ヘパリン単独、すなわち精子処理にはカフェインを含むＢＯ液にヘパリンを添加した受精培地が最も有効であることが示された。しかし、１頭の種雄牛においてヘパリンを添加した区の前核形成卵の割合が６０％に達せず、カフェインを含むＢＯ液にヘパリンを添加した受精培地での精子処理も不十分と考えられた。

（３）体外受精胚の発生培養酸素濃度にかかわらず、卵丘細胞との共培養の区と比較して非共培養の区の方が分割卵、８細胞期胚および胚盤胞の割合が高かった。非共培養の区では、分割卵８細胞期胚および胚盤胞の割合は、酸素濃度が２０％の区と５％の区とのあいだに有意差は見られなかったが、５％の区でそれぞれ５２．７％３９．２％および４８．２％と最も高い値が得られた。これらのことから、ウシ体外受精胚は、発生培地に３％子ウシ血精を添加した修正ＴＡＬＰを用い、共培養によらず、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の気相条件で培養することにより、４０％以上の高率で胚盤胞の得られることが示された。

（４）以下の方法により１頭から平均３−５個の胚盤胞が得られる。
　１）成熟培養：注射器により吸引採取したすべての卵子を１０％子ウシ血清を添加したＴＣＭ１９９で２４−２６　　　時間培養する。
　２）受精：成熱培養を終了した卵子を、５ｍＭカフェインと２units／ｍｌヘパリンを含むＢＯ液で３−４時間前培　　　養した精子に導入する。
　３）発生培養：授精後５−６時間目に卵子の卵丘細胞を剥離して除去し、３％子ウシ血清を含む修正ＴＡＬＰ　　　　に移す。授精後８−１０日目（授精日を１日目とする）まで培養を継続する。
　４）気相条件：成熟培養および受精は３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気、発生培養は３９℃、５％Ｃ０２、５％Ｏ２、　　　９０％Ｎ２とする。

４．成果の活用面と留意点

　（１）本研究における精子の受精能獲得誘起方法は、種雄牛により効果が異なる。
　（２）血清およびＢＳＡは、ロットにより良否があるので、事前にロットの検討が必要である。
　（３）培地を作成する水は、超純水が望ましい。

５．残された問題とその対応

　（１）生体内卵子の採取と体外受精法の検討
　（２）すべての種雄牛に有効な精子の受精能獲得誘起方法の検討
　（３）体外受精胚の耐凍性の向上