【研究参考】
成績概要書 　　　　　　　　　　　　　　　　 (作成　平成９年 1月）
課題の分類
研究課題名：ＲＴ−ＰＣＲ法によるテンサイそう根病ウイルスの検出
　　　　　　（作物ウイルス病の防除技術開発）
予算区分：道費
担当科：中央農試生物工学部遺伝子工学科
試験期間：平成６〜８年
協力・分担関係：なし

１．目的
　テンサイそう根病は、カビの一種Polymyxabetaeによって媒介されるウイルス病である。病原ウイルスは外被タンパク質と４〜５種類のＲＮＡ遺伝子から成る。近年開発された、極微量のＤＮＡを数時間の間に増幅する技術ＰＣＲ法を利用して、てんさいの根からＰＣＲ法により簡便にウイルスＲＮＡを検出し、ウイルスの系統を診断する手法を開発する。

２．試験方法
①供試材料
　ウイルス分離株Ｓ−４５（ＲＮＡ−１＋２＋４＋５）またはＳ−３４５（ＲＮＡ−１＋２＋３＋４＋５）に感染したてんさい細根、発病圃場から採取したてんさい・土壌
②核酸の調製
　ＳＤＳ−フェノール法、ｌＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）、Sepagene（三光純薬）
③ＲＴ−ＰＣＲ
　逆転写酵素（スーパースクリプトⅡ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）でファーストストランドを合成し、ＰＣＲを行った（９４℃−１分・５０℃−１分・７２℃−２分のサイクルを３５回）。
④土壌検診
　土壌にてんさいの苗を移植し、細根をエライザ法とＲＴ−ＰＣＲ法で検定した。

３．結果の概要
①てんさいの根からＲＴ−ＰＣＲ用の核酸を調製する方法として、従来から用いているＳＤＳ−フェノール法と２つの市販のキット（ＩＳＯＰＬＡＮＴおよびSepagene）とを比較した。根からの核酸調製には、検出感度からみて、Sepageneが適していた。核酸は、生重に対して１０倍に希釈して用いるのが適当であると考えられた。
②てんさいの根からSepageneを用いて核酸を調製し、ＲＮＡ−３、ＲＮＡ−４およびＲＮＡ−５に対するプライマーを設定して特異性と感度を比較し、各ＲＮＡを特異的に検出できるプライマーをスクリーニングした。検出感度はエライザ法とほぼ同等であった。これらのプライマーを用いて、発病圃場より採取したてんさいの根からウイルスＲＮＡを検出することができた。
③ウイルス濃度の高い土と低い土を用いて、エライザ法とＲＴ−ＰＣＲ法による土壌検診の感度を比較した。ＲＴ−ＰＣＲ法では、いずれの土からも病土移植５日後のてんさい苗の細根からウイルスＲＮＡが検出され、エライザ法と同等以上の感度が得られた。発病圃場から採取した土壌をＲＴ−ＰＣＲ法で検定したところ、ＲＮＡ−３、ＲＮＡ−５を検出することができ、ウイルス系統を診断することができた。

表1　異なる方法で調製した核酸からのRT-PCR法
　　　　によるウイルスRNAの検出
核酸調製法 生重に対する希釈倍率
1 10 102 103 104 105 106
SDS-フェノール法 - + + + + + -
ISOPLANT NT - + + + + -
SepaGene NT + + + + + +
　NT:検定せず

表2　エライザ法とRT-PCR法による土壌検診の感度
土壌 移植後
日数		 エライザ法 RT-PCR法
30分の吸光度
(A405)		 60分の吸光度
(AA405)		 検出 RNA-3 RNA-5
So4 5 0.009 0.018 - - -
0.020 0.047 - + +
0.009 0.O15 - - -
15 0.020 0.045 - - -
0.019 0.042 - - -
0.025 0.056 - + +
Bi6 5 0.120 0.298 + + +
0.134 0.337 + + +
0.084 0.201 + + +
健全 5 0.008 0.015 - - -
15 0.O10 0.015 - - -
　1)健全土の吸光度は平均値。
　2)エライザ法の+と-は、ウイルス検出の有無を示す。
　3)RT-PCR法の+と-は、各RNAのバンドの検出が有無を示す。

４．得られた成果とその活用
　①ＲＴ−ＰＣＲ法によりテンサイそう根病ウイルスのＲＮＡ−３、ＲＮＡ−４およびＲＮＡ−５を検出することができ、診断に利用できる。
　②検診土壌に移植したてんさい苗の細根または圃場から採取したてんさいの根を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりウイルスの系統を検定することができる。
　③ＲＴ−ＰＣＲ用の核酸は、てんさいの根から市販のキットを用いて調製することができる。
　④ここで得られた知見は、塩基配列情報のある他のウイルスに利用できる。
　⑤ＰＣＲ法を利用した多型検出法の一つ、ＳＳＣＰ（singlestrandconformationpolymorphism、一本鎖高次構造多型）法に応用できる。

５．残された問題点
　①さらに簡便な核酸調製法の開発およびＰＣＲの省力化
　②直接的な検出法の開発
　③定量法の開発