成績概要書 （作成 平成１２年１月）
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研究課題名：そうか病菌の定量法 （ジャガイモそうか病総合防除法開発試験 Ⅰ．病原菌の診断技術開発） 予算区分：道費 担当科：十勝農試 研究部 病虫科 中央農試 病虫部 土壌微生物科 研究期間：平９〜１１年 協力・分担関係：北海道大学農学部 |
１．目 的
ジャガイモそうか病の防除対策の確立のためには、土壌中の病原菌の動態を解明することが必要である。そのために土壌中の病原菌の定量法を開発する。
２．方 法
（１）選択分離培地の作成：抗菌性物質の探索、基本培地の改良
（２）血清学的手法による識別：ﾎﾟﾘ・ﾓﾉｸﾛｰﾅﾙ抗体の作成、反応特異性の検討
（３）PCRによる識別：種特異的ﾌﾟﾗｲﾏｰによる反応特異性の検討
（４）そうか病菌の定量：選択分離培地、ELISA,PCRによる土壌中の病原菌量評価
３．結果の要約
１．選択分離培地の作成
（１）選択分離培地の作成を目的に、36種の抗菌性物質、24種の色素・阻害剤について、そうか病菌と土壌細菌に対する生育抑制効果を調べた。その結果、ﾅﾘｼﾞｷｼﾝ酸、ﾒﾁｼﾘﾝ、 ﾃﾞﾋﾄﾞﾛ酢酸ﾅﾄﾘｳﾑ、塩化ﾘﾁｳﾑなどがそうか病菌の生育に影響が少なく、土壌細菌の生育を抑制して有望であった。
（２）基本培地としてはConnら(1998)の報告したS.scabiesのための選択分離培地(STR培地)が優れた。しかし、菌株によって生育抑制が見られたため、改良が必要であった。
（３）選択分離培地として、S.turgidiscabies用にはSTRの基本組成のﾘﾌｧﾝﾋﾟｼﾝを塩化ﾘﾁｳﾑ 5,000ppm,ﾃﾞﾋﾄﾞﾛ酢酸ﾅﾄﾘｳﾑ1,000ppm,ﾒﾁｼﾘﾝ0.5ppmで代替えした培地が有効であった。
S.scabies用にはSTRの塩化ﾅﾄﾘｳﾑを0.5％，ﾘﾌｧﾝﾋﾟｼﾝを0.5ppm，ｼｸﾛﾍｷｼﾐﾄﾞを100ppm,ﾅﾘｼﾞｷｼﾝ酸を20ppmに改変し、さらにﾃﾞﾋﾄﾞﾛ酢酸ﾅﾄﾘｳﾑ350ppm,塩化ﾘﾁｳﾑ2,000ppm,ﾄﾘﾒｿﾌﾟﾘﾑ 20ppm,ﾎﾟﾘﾐｷｼﾝB硫酸塩1ppmを添加した培地が有効であった(表1,2）。
２．血清学的手法による識別
（１）3種のそうか病菌S.scabies,S.turgidiscabies,S.acidiscabiesに対する抗血清を作成し、血清学的類縁性を調べた。本邦産のそれぞれの菌種は互いに血清学的に特異な菌群を形成していた。しかし、S.scabiesはDiastatochromogenes groupの3種と類縁性が高かった。
（２）S.turgidiscabies,S.acidiscabies に対して作成したﾎﾟﾘｸﾛｰﾅﾙ抗体はそれぞれの免疫原の菌種に対する反応性が高く、ELISAによる特異的識別が可能であった(表4)。
(３）S.scabiesに対して作成したﾓﾉｸﾛｰﾅﾙ抗体はDiastatochromogenes groupを含め他菌種との交差反応が見られず、ELISAによるS.scabiesの特異的識別が可能であった(表5)。
３．PCRによる識別
（１）3種のそうか病菌に対して設計されたプライマーを用いたPCRにより、それぞれの菌種の特異的な識別が可能である。
４．そうか病菌の定量
（１）作成した選択分離培地を用いた土壌希釈平板法によって分離した放線菌をPCRと
ELISAにより識別を行い、土壌中のそうか病菌の菌量を評価した。S.turgidiscabiesの優占土壌における菌量は、激発圃場においても105cfu/g・乾土以下、S.scabies 優占土壌では中〜多発生圃場においても103〜104cfu/g・乾土と推定された(表5,6)。
表1 そうか病菌分離のための基礎培地
| 可溶性ジャガイモ澱粉 | 5.0 g |
| 酵母エキス | 4.0 g |
| バクトペプトン(Difco) | 0.6 g |
| プロテオーゼペプトンNo.3 | 0.6 g |
| K2HPO4 | 1.0 g |
| MgSO4 | 0.5 g |
| FeSO4 | 10.0 mg |
| ZnSO4 | 1.0 mg |
| MnCl | 1.0 mg |
| 寒天(E.Merck) | 17 g |
| 蒸留水 | 1,000 ml |
表2 添加抗生物質
| S.turgidiscabies ｼｸﾛﾍｷｼﾐﾄﾞ 200ppm,ﾅｲｽﾀﾁﾝ 5.6ppm ﾃﾞﾋﾄﾞﾛ酢酸ﾅﾄﾘｳﾑ 1,000ppm,ﾅﾘｼﾞｷｼﾝ酸 15ppm 塩化ﾘﾁｳﾑ 5,000ppm,ﾒﾁｼﾘﾝ 0.5ppm 塩化ﾅﾄﾘｳﾑ 10.0g |
| S.scabies ｼｸﾛﾍｷｼﾐﾄﾞ 100ppm,ﾄﾘﾒｿﾌﾟﾘﾑ 20ppm ﾃﾞﾋﾄﾞﾛ酢酸ﾅﾄﾘｳﾑ 350ppm,ﾅﾘｼﾞｷｼﾝ酸 20ppm 塩化ﾘﾁｳﾑ 2,000ppm,ﾎﾟﾘﾐｷｼﾝB硫酸塩 1ppm, ﾘﾌｧﾝﾋﾟｼﾝ 0.5ppm,塩化ﾅﾄﾘｳﾑ 5.0g |
表3 ELISAにおける2種のモノクローナル抗体の
各種Streptomycesとの反応性
| 菌種 | 菌株数 | 反応性(A415)a) | |
| 7F11H10 | 78EH10 | ||
| S.scabies melanin(+) | 10 | ++ | ++ |
| S.scabies melanin(-) | 13 | ++ | ++ |
| S.acidiscabies | 4 | − | − |
| S.turgidiscabies | 25 | − | − |
| S.aureofaciens | 1 | − | − |
| S.flaveolus | 1 | − | − |
| S.griseus subsp.griseus | 3 | − | − |
| S.eurythermus | 2 | − | − |
| S.neyagawaensis | 2 | − | − |
| S.bottropensis | 2 | − | − |
| S.diastatochromogenes | 3 | − | − |
| S.sampsonii | 1 | − | − |
| S.tendae | 1 | − | − |
| S.setonii | 1 | − | − |
| S.anulatus | 1 | − | − |
| S.tumuli | 1 | − | − |
| S.exfoliatus | 1 | − | − |
| S.albidoflavus | 1 | − | − |
| S.ipomoea | 1 | − | − |
| S.cheroniumii | 9 | − | − |
| Nocardia brasiliensis | 1 | − | − |
表４ 抗S.acidiscabies特異抗体を用いた
ELISA検定の吸光値
| 菌種（菌群） | 菌株数 | 吸光値 (405nm） |
| Streptomyces acidiscabies a) | 3 | 1.11〜1.21 |
| S.turgidiscabies | 2 | 0.07〜0.09 |
| S.scabies a) | 2 | 0.09〜0.10 |
| S.scabies melanin(-) | 13 | 0.08〜0.10 |
| S.scabies melanin(+) | 10 | 0.09〜0.12 |
| Streptomyces sp.(D菌群) | 3 | 0.08〜0.12 |
| S.sampsonii a) | 1 | 0.10 |
| S.setonii a) | 1 | 0.20 |
| S.griseus subsp.griseus a) | 2 | 0.07〜0.12 |
| S.griseus | 1 | 0.08 |
| S.tendae a) | 1 | 0.12 |
| S.bottropensisa) | 1 | 0.05 |
| S.eurythermus a) | 1 | 0.03 |
| S.neyagawaensis a) | 1 | 0.04 |
| S.diastatochromogenesa) | 1 | 0.20 |
| S.flaveolus | 3 | 0.07〜0.08 |
| S.tumuli | 1 | 0.07 |
| S.anulatus | 1 | 0.12 |
| 亀の甲症菌 | 10 | 0.07〜0.09 |
表5 S.turgidiscabiesの土壌中の菌量(1998,秋)
| 供試土壌 | 発病程度a) (発病度) |
検出菌量 (cfu/g・乾土) |
| 十勝農試場内 | 甚発生(100) | 1.7×105 |
| 北見農試場内 | 甚発生( 70) | 1.2×104 |
| 芽室町博進 | 甚発生( 30) | 2.3×103 |
表6 S.scabiesの土壌中の菌量(1998・1999,秋)
| 土壌採取地 | 発病程度a) | 検出菌量 (cfu/g・乾土) |
| 北海道今金町 | 中発生 | 1.5×104 |
| 大野町 | 中発生 | 5.3×103 |
| 長崎県加津佐 | 多発生 | 1.1×104 |
| 〃 | 多発生 | 5.8×104 |
| 愛野町 | 多発生 | 3.9×103 |
| 佐賀県有田 | 中発生 | 4.4×103 |
４．成果の活用面と留意点
（１）本試験で得られたそうか病菌の生理的性質、血清学的性質に関する知見ならびに定量法は今後の生態研究の参考とする。
５．残された問題点
（１）コロニーELISA法など、より簡便な定量法の開発
（２）低密度の菌量の検出