成績概要書(作成 2004年1月)
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研究課題名：ダイコンバーティシリウム黒点病のPCR土壌診断による被害回避指針
(ダイコンバーティシリウム黒点病に対する高精度簡易土壌検診法の開発)
(土壌検診によるダイコンバーティシリウム黒点病の被害回避対策)
担当部署：花・野菜技術センター 研究部 病虫科
十勝農業試験場 生産研究部 てん菜畑作園芸科
協力・分担関係：南羊蹄地区農業改良普及センター
十勝東部地区農業改良普及センター
十勝中部地区農業改良普及センター
予算区分：国費補助(地域基幹)
研究期間：1999〜2003年度(平成11〜15年度)
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1.目 的
ダイコンバーティシリウム黒点病に対する簡易で迅速な土壌検診法を開発し，ダイコン作付けに当たって被害回避対策の指針とする。
2.方 法
PCR検定による土壌検診法の開発に取り組んだ。
1)プライマー設定
ダイコンバーティシリウム黒点病菌(Verticillium dahliae, V. albo-atrum)を特異的に検出するプライマーの設定について検討した。
2)土壌からの核酸抽出方法
液体窒素，フェノール・クロロホルムを用いない，マイクロチューブ内での土壌からの核酸抽出方法について検討した。
3)抽出核酸の純化
土壌から抽出した核酸をPCR反応に使用可能な試料とするための純化方法について，市販の核酸純化キットの比較検討を行った。
4)PCR検定と微小菌核定量結果との関係
PCR検定と本病原菌微小菌核密度定量結果との比較検討を行った。
5)PCRによる土壌検診
圃場から採取した土壌についてPCR検定および微小菌核密度定量を行うとともに，ダイコン作付け後の本病発病程度を調査し，検定結果と発病との関係を調査した。
6)ダイコンバーティシリウム黒点病に対する耕種的防除
汚染圃場においてだいこんを栽培し，本病への抵抗性品種間差を確認した。また，作型についても検討した。
3.成果の概要
1)V. dahliae, V. albo-atrum のITS領域の配列を基に両種を特異的に検出するプライマーセットを設定した。
2)ガラスビーズを用い，マイクロチューブ1本で行う土壌からの核酸抽出方法を開発した。
3)市販の核酸純化キットのうち，土壌検診に適したキットを選抜した。
4)本病発生圃場の土壌についてPCR検定を行った結果，生土0.2gからの検定では微小菌核密度10個以上の土壌から検出が可能だった。
5)圃場の微小菌核密度とだいこんの発病との関係は明らかにできなかったものの，風乾調製した土壌0.1gを2反復でPCR検定した結果，1本でも＋反応が出た試料については，本病の発生が認められた。
6)風乾調製の期間を除けば，PCRによる検診に要する時間は1日程度であり，これまで3〜4週間かかっていた検定時間を大幅に短縮することができる。また，特別な技術を必要としないため，PCRを行える環境であれば誰にでも検診が可能である。
4.成果の活用面と留意点
1)ダイコンバーティシリウム黒点病の被害回避指針として活用する。
2)検診結果による対策の選択に当たっては前歴における発生程度を考慮する。
3)本試験における土壌検診の対象はV. dahliae のみである。
5.残された問題とその対応
1)土壌消毒，作付け回避以外の被害回避対策
2)PCR検診結果とバーティシリウム黒点病発病程度に関する知見の集積
