| 研究課題：LAMP法による牛ヨーネ菌検出 （LAMP法による牛ヨーネ病迅速診断法の実用化） 担当部署：畜試 基盤研究部 遺伝子工学科、感染予防科 協力分担：（独）動物衛生研究所、栄研化学株式会社 予算区分：道費（重点領域） 研究期間：2004〜2006年度（平成16〜18年度） |
北海道における牛ヨーネ病患畜は2006年に555頭、2007年には7月の時点で422頭と減少傾向がみられない。畜産試験場は2004年1月に国産の遺伝子増幅技術であるLAMP法を用いた牛糞便からのヨーネ菌遺伝子検出法を開発したが、検出感度が0.05pg/testと低く、また検出時間が90分間と長いため、改良が必要であった。
本試験では、新たにプライマーを作製し、LAMP法の検出感度向上および反応時間短縮を目指した。
２．方法
１）新規プライマーの設計
LAMP法による牛ヨーネ菌検出法の検出感度向上と反応時間短縮のために、新たにプライマーを作製し、そのプライマーを用いたLAMP法の検出感度と特異性を検討した。
２）糞便試料からのヨーネ菌DNAの検出
疫学的にヨーネ菌が含まれていないと考えられる糞便試料（陰性糞便試料）を用いて、LAMP法の精度を検討した。また、ヨーネ病患畜から採取した糞便試料（患畜糞便試料）やヨーネ病発生農家の牛群から採取した糞便試料（継続検査試料）を用いて糞便培養法、LAMP法およびリアルタイムPCR法によるヨーネ菌検出結果を比較検討した。
患畜糞便試料を用いた試験では、糞便培養法の結果をそのコロニー数に基づいてスコア化した「培養スコア」を用い、LAMP反応において濁度0.1に達した時間「Tt値」を用いて、検出結果を比較検討した。培養スコアは、コロニーの形成がなかった試料を0、コロニー数が1〜9個の試料を1、10〜99個の試料を2、コロニー数100個以上の試料を3とした。また、LAMP法のTt値とリアルタイムPCR法のCt値（リアルタイムPCR法において一定の増幅産物に達するサイクル数）との関係を検討した。
３．成果の概要
１）新たに設計したプライマーF17によるLAMP法は、リアルタイムPCR法と同程度の検出感度であり、40分間のLAMP反応によりヨーネ菌DNA0.005pg/testを検出した（図1）。また、高濃度のヨーネ菌類似菌DNAは50分以降に増幅したが、想定している判定時間以降の増幅であり識別可能であった。またプライマーダイマーに起因する非特異増幅は120分間までは生じなかった。
２）陰性糞便10試料から調製したDNA試料においてLAMP法による増幅反応はみられなかった。
３）患畜糞便58試料のうち糞便培養法陽性の16試料すべてにおいてLAMP法によりヨーネ菌DNAを検出した（表1）。培養スコアが大きくなるとLAMP法のTt値が小さくなる傾向がみられた（図2）。LAMP法の検出結果は、リアルタイムPCR法の検出結果とほとんど一致し（93.1％）（表2）、またLAMP法のTt値とリアルタイムPCR法のCt値に相関（R2＝0.736）があった（図3）。
４）継続検査試料において糞便培養法陽性の9試料のうちLAMP法により検出できたのは3試料であった。糞便培養法において確認されたコロニー数が少ない試料において、LAMP法およびリアルタイムPCR法で検出されないものもあったが、LAMP法検出結果はリアルタイムPCR法の検出結果とほとんど一致した（96.8％）。
以上のとおり、LAMP法の改良により、リアルタイムPCR法と同程度の感度で糞便中ヨーネ菌DNAを検出することが可能となり、LAMP反応時間は90分間から40分間までに短縮できた。
表1 患畜糞便試料からの検出（n=58） 表2 LAMP法とリアルタイムPCR法の比較
図1 ヨーネ菌DNA試料を用いた検出感度
図2 培養スコアとLAMP法のTt値の比較 図3 LAMP法のTt値と
リアルタイムPCR法のCt値の比較
４ 成果の活用面と留意点
１）ヨーネ菌用培地上に形成したコロニーのヨーネ菌同定に活用できる。
２）本検査法は、国の「牛のヨーネ病防疫対策要領」および北海道の「牛のヨーネ病防疫対策実施要領」において、牛ヨーネ病の検査法に規定されておらず、現段階では、診断に利用できない。
３）LAMP試薬キットを2008年度発売の予定。
５ 残された問題とその対応
ヨーネ病診断に利用できる検査法となるには、糞便からの簡易なヨーネ菌DNA抽出法の開発による多検体検査への応用が残されており、現在進行中の試験課題（「多検体検査に適したヨーネ病遺伝子診断法の改善」平成2007〜2008年度 民間共同）で取り組んでいる。