【 背景・ねらい 】
　牛では生まれた子牛が雄か雌かによって経済価値が大きく変わる場合がある。また、2胚移植による双子生産では、移植する胚の性別がわからないので、フリーマーチンの発生は避けられない。従って、目的に応じて人為的に産子の性を支配する技術の利用価値は高い。最近になり遺伝子工学的技術が発達し、中でも目的とするDNA断片のみを大量に増幅できるPCR法は畜産の分野でも利用されはじめている。
　本試験では、牛胚の性判別にPCR法が適用できるかを検討した。また新たに牛のY染色体に特異的なDNAを探索・解析し、それをもとに新しいプライマーの開発を目指す。

【 成果の内容・特徴 】

1. PCR法を用いて牛胚の一部をサンプルとして雄に特異的なDNAを増幅・検出することにより、牛胚の性判別を行うことができた。また性判別した胚の移植試験・凍結試験を行った結果、コンタミネーション(不純物や不要なDNAの混入)による誤判別および胚を傷つけることによる耐凍性低下の問題が明らかとなった(表1)。
2. サザンハイブリダイゼーションで雌雄による違いを示したDNA断片について塩基配列を解析した。得られた塩基配列を基にプライマーを3組(A、B、C)設計しPCRを行った結果プライマーAとCでは雄にのみバンドが1本検出され、プライマーBでは雄のバンドに加え雌雄共通のバンドが検出された(図1)。
   プライマーBについて胚の一部をサンプルとしてPCRを行い、染色体検査による雌雄判定の結果と比較したところ全て一致した(表2)。この結果から、検出されるバンドが2本なら雄、1本なら雌、バンドが見られない場合はサンプリングミスというように、プライマーBを用いたPCRによりサンプリングミスのチェックと雌雄の判別が同時に行えることが示された。

【 成果の活用面・留意点 】
　PCR法は極めて高感度なので、サンプル採取時およびPCR増幅後の試料のコンタミネーション(不純物や不要なDNAの混入)には特に注意が必要である。 　なお、解析した雄特異的部分を含む塩基配列およびそれを基に設計した性判別用プライマーについては特許出願中である。

【 具体的データ 】

表1．性判別胚の移植成績
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　　実施年度　　　 移 植 頭 数　　 受胎頭数(%) 分娩頭数　　適中率
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　　　　　　　　　新鮮胚　 13　　　 6(46.1)　　 6　　 66.7%(4/6)
　平成3〜4年
　　　　　　　　　凍結胚　　 8　　　 3(37.5)　　 3　　 66.7%(2/3)
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　平成　6　年　　凍結胚　 35　　　 9(25.7)　　 71)　100.0%(7/7)
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　　　合　計　　　　　　　 56　　 18(32.1)　 14　　 81.3%(13/16)
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 1)2頭流産



表2．プライマーBを用いたPCRと染色体検査の結果
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　　　　　　　　 PCRによる
　 検査胚数　　　　　　　　　　　　染色体検査結果　　 判定一致率
　　　　　　　　　 判定結果　　　　　　　　　　　　　　 (%)
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　　　　　　　　　♂　　26　　　　 ♂　　26　　　　 100
　　 36
　　　　　　　　　♀　　10　　　　 ♀　　10　　　　 100
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【 その他 】

研究課題名：牛胚の性判別に関する試験
予算区分　：道単
研究期間　：平成7年度(平成3年〜6年)
研究担当者：陰山聡一、山本裕介
発表論文等：陰山聡一・山本裕介・南橋　昭・森安　悟・伊東季春・千国幸一、雌雄多型を示すゲノムDNA断片による牛胚の性判別(第90回日本畜産学会大会講演要旨　1995)

　　　　　　　 「平成8年度普及奨励ならびに指導参考事項」　P.409